روش ساخت محیط های کشت

محیط هاي کشت نقش اساسی را در آزمایشگاه میکروب شناسی ایفا می کنند و به طور گسترده اي جهت جداسازي، تعیین
هویت و آنتی بیوگرام میکروارگانیسم هاي بیماري زا به کار می روند. بسیاري از آزمایشگاه ها به طور روتین محیط هاي کشت
مورد نیاز براي مصارف تشخیصی و تحقیقاتی را خودشان تهیه می نمایند. با این همه براي اطمینان از این که محیط هاي کشت،
کیفیت خوب و نتایج مطلوبی دارند، باید روش هاي کنترل کیفی مناسبی به کار گرفته شود. براي رسیدن به این هدف باید در
تهیه و مصرف محیط هاي کشت معیارهاي ذیل در نظر گرفته شود

 

نکات عمومی در مورد تهیه محیط های کشت : 

آب:کیفیت محیط هاي کشت به طور مستقیم به کیفیت مواد خام مورد استفاده در تهیه آنها بستگی دارد. آب یکی از مهمترین موادي
است که در تهیه محیط هاي کشت به کار می رود. سه معیار مهم براي آب مورد استفاده در تهیه محیط هاي کشت )آب نوع III )
شااامل عدم وجود یون هاي مس، قدرت هدایت الکتریکی و pH می باشااد. در شاارایط ایده آل یون هاي مس به دلیل خا اایت
مهارکنندگی براي اغلب میکروارگانیساام ها، نباید در آب مورد اسااتفاده براي تهیه محیط هاي کشاات وجود داشااته باشااد. قدرت
هدایت الکتریکی آب باید حدود 10 میکروزیمنس بر سانتی متر با شد و همچنین pH آب مورد ا ستفاده بهتر ا ست کمی ا سیدي
باشد، ولی نباید کمتر از 5 و بیشتر از 8 باشد.

توزین پودر محیط کشت و افزودن آب:
طبق دستورالعمل تهیه محیط کشت که بر روي ظرف آن نصب گردیده است، مقدار مناسبی از پودر محیط کشت را با دقت وزن نمایید. ظرف محیط کشت را دور از جریان هوا و رطوبت باز کنید. از استنشاق پودرها به خصوص آنهایی که داراي مواد سمی هستند و تماس طوالنی مدت آنها با پوست اجتناب کنید.پودر را به سرعت، به دقت و بدون ایجاد غبار وزن کنید. هرچه زودتر درِ ظرف را ببندید. نصف حجم آب مورد نیاز را داخل ظرف بریزید. سپس مقدار وزن شده محیط کشت را به آن اضافه نمایید.
براي چند دقیقه به تندي تکان دهید. باقیمانده آب را به دیواره داخلی ظرف بریزید تا ذرات محیط کشت چسبیده به دیواره نیز
وارد محلول شوند. این مرحله بسیار مهم است، چون پودر خشک محیط کشت در باالي سطح آب، ممکن است در اتوکالو استریل
نشود و منبع آلودگی گردد.

حل کردن محیط کشت:

محیط هاي کشت بدون آگار، معموال با تکان دادن آهسته و مالیم حل خواهند شد. اما محیط هاي کشت حاوي آگار باید قبل از
حرارت دادن به مدت چند دقیقه با آب مخلوط شوند. سپس حرارت داده شوند تا آگار قبل از اتوکالو کردن، حل شود. محیط
هاي کشت را بجوشانید بدون آنکه بسوزند. محیط هاي کشتی که نباید اتوکالو شوند، بعد از این مقدار حرارت دادن، براي تقسیم

داخل پلیت ها یا ظروف استریل دیگر آماده خواهند بود. اکثر محیط هاي کشت به استریلیزاسیون نهایی )در دماي C°121 به
مدت 15 دقیقه( نیاز خواهند داشت.

توزیع:
محیط کشت را در ظرفی مناسب با حجم 2 تا 3 برابر حجم محیط کشت بریزید تا بتوانید آن را به خوبی تکان دهید و مخلوط
کنید.

استریلیزاسیون:
بعضی از محیط هاي کشت به استریلیزاسیون با اتوکالو احتیاجی نداشته و با جوشاندن قابل استفاده می شوند که دستور ساخت
آنها بر روي برچسب ظرف محیط کشت قید گردیده است. استریلیزاسیون سایر محیط هاي کشت توسط حرارت مرطوب )اتوکالو(
یا افی غشایی )فیلتراسیون( انجام می گردد که این موارد نیز بر روي برچسب ظرف محیط کشت قید گردیده است.

آماده سازی جهت مصرف:

بعد از استریلیزاسیون، اجازه دهید دماي محیط کشت به حدود C°50 برسد، سپس با رعایت شرایط آسپتیک در ظروف نهایی
تقسیم نمایید. هیچ وقت محیط کشت را در دماي باالتر از C°50 تقسیم نکنید. مکمل هاي حساس به گرما و حرارت باید بعد از
این که دماي محیط کشت به حدود C°50 رسید، به آن اضافه شوند. دماي مکمل )ساپلمنت( استریل قبل از این که به محیط
کشت اضافه شود، باید به دماي اتاق برسد. سپس مکمل را با رعایت شرایط آسپتیک به محیط کشت اضافه نموده، خوب مخلوط
کنید و در ظروف نهایی که از قبل استریل شده اند، تقسیم نمایید

اندازه گیری و تنظیم pH:

محیط هاي کشت دهیدراته اگر به طور مناسب تهیه شوند، نیازي به تنظیم pH ندارند. pH نهایی محصول استریل شده را می توان
روي پلیت یا بطري اندازه گیري کرد، اما باید آنها را بعد از سنجش pH دور ریخت. بنابراین بعد از استریل شدن و خنک شدن
محیط کشت تا دماي C°25 ،مقدار pH را در حد مورد نظر )2/0 )±تنظیم نمایید. تنظیم pH معموالً با استفاده از هیدروکسید
سدیم 40 گرم در لیتر )تقریباً یک موالر( و یا با استفاده از اسید کلریدریک 5/36 گرم در لیتر )تقریباً یک موالر( انجام می شود.

 

نگهداری محیط های کشت تهیه شده:

طول عمر محیط هاي کشت تهیه شده به نوع اجزاء تشکیل دهنده محیط، نحوه نگهداري و ذخیره سازي آنها بستگی دارد. تمامی
محیط هاي کشت باید دور از نور نگهداري شوند. تابش نور به محیط هاي کشت موجب تشکیل مواد باکتریوستاتیک و باکتریساید
مانند پراکسیداز می گردد. طول عمر اغ لب محیط هاي کشت پلیتی در دماي 4 درجه سانتی گراد یک هفته می باشد ، ولی اگر در
داخل کیسه هاي پالستیکی به گونه اي بسته بندي شوند که هوا داخل آنها نفوذ نکند، تا 4-3 هفته قابل مصرف هستند. طول عمر
محیط هاي کشااات حاوي آنتی بیوتیک به پایداري آنتی بیوتیک موجود در آن بساااتگی دارد. در مجموع، محیط هاي حاوي آنتی
بیوتیک را در مدت یک هفته باید م صرف کرد. از سوي دیگر با گذ شت زمان این گونه محیط هاي ک شت رطوبت خود را از د ست
داده، به دلیل افزایش غلظت آنتی بیوتیک، قدرت انتخابی آنها افزایش می یابد. پلیت ها را باید قبل از م صرف به دماي اتاق ر ساند.
اگر پلیت محیط ک شت بیش از 8 ساعت در دماي اتاق باقی بماند براي م صرف منا سب نمی با شد. محیط هاي ک شت لوله اي در
مقایسه با محیط هاي کشت پلیتی عمر طوالنی تري دارند. اغلب این محیط هاي کشت اگر در دماي 4 درجه سانتی گراد نگهداري
شوند، 6-3 ماه قابل مصرف می باشند.