انواع محیط های کشت

محیط کشت باکتری چیست؟

محیط کشت باکتری باید به گونه‌ای تهیه شود که قبل از تلقیح با یک باکتری خاص، استریل باشد تا تنها نوع باکتری موجود در نمونه باشد. محیط کشت باید هر آنچه باکتری برای تکثیر نیاز دارد را فراهم کند، بنابراین دما، اسیدیته، نوع بستر، مواد غذایی و اکسیژن اهمیت دارند. تعداد محیط موجود برای رشد باکتری قابل توجه است. برخی از محیط‌های کشت عمومی از رشد طیف وسیعی از ارگانیسم ها پشتیبانی می‌کنند. یک نمونه برجسته از یک محیط همه منظوره، آبگوشت سویا آزمایشگاهی (TSB) است.

از محیط‌های تخصصی در شناسایی باکتری‌ها استفاده می‌شود و با رنگ‌ها، شاخص‌های pH یا آنتی‌بیوتیک‌ها تکمیل می‌شود. یک نوع ماده غنی شده شامل فاکتورهای رشد، ویتامین‌ها و سایر مواد مغذی ضروری برای رشد ارگانیسم‌های سریع‌الرشد است، ارگانیسم‌هایی که نمی‌توانند مواد مغذی خاصی ایجاد کنند و نیاز به افزودن آن‌ها به محیط دارند.

وقتی ترکیب شیمیایی کامل یک محیط شناخته شود، آن را یک محیط شیمیایی تعریف شده می‌نامند. به عنوان مثال در محیط EZ، تمام اجزای شیمیایی منفرد شناسایی شده و مقدار دقیق هر یک از آن‌ها مشخص است. در محیط‌های پیچیده که حاوی عصاره و هضم مخمرها، گوشت یا گیاه هستند، ترکیب شیمیایی دقیق محیط شناخته شده نیست. مقدار اجزای منفرد تعیین نشده و متغیر است. آبگوشت مغذی، آبگوشت سویای آزمایشگاهی و تزریق قلب مغز، همگی نمونه‌هایی از محیط پیچیده هستند.

به محیط کشت‌هایی که از رشد میکروارگانیسم‌های ناخواسته جلوگیری کرده و با تأمین مواد مغذی و کاهش رقابت از رشد ارگانیسم مورد علاقه حمایت می‌کنند، محیط کشت انتخابی گفته می‌شود. نمونه‌ای از یک محیط انتخابی مک‌مانکی آگار است. این ماده حاوی نمک‌های صفراوی و بنفشه کریستالی است که در رشد بسیاری از باکتری‌های گرم مثبت تداخل ایجاد کرده و رشد باکتری‌های گرم منفی، به ویژه انتروباکتریاسه را ترجیح می‌دهد. این گونه‌ها معمولاً روده‌ای نامیده می‌شوند، در روده زندگی می‌کنند و با وجود نمک‌های صفراوی سازگار هستند. فرهنگ‌های غنی‌سازی رشد ترجیحی یک میکروارگانیسم مورد نظر را که نمایانگر کسری از ارگانیسم های موجود در یک تلقیح است، پرورش می‌دهد.

 

انواع محیط کشت باکتری چه هستند؟

بر اساس فاکتورهای مختلفی می‌توان محیط کشت باکتری را تقسیم بندی کرد. به طور مثال از نظر بستر محیط کشت سه نوع دارد:

• محیط کشت جامد: کشت جامد میکروارگانیسم‌های گرما دوست برای کشت‌های ورق جامد میکروارگانیسم‌های گرمادوست نظیر Bacillus
•  acidocaldarius ،Bacillus stearothermophilus ،Thermus aquaticus و Thermus thermophilus و غیره که در دمای 50 تا 70 درجه سانتی‌گراد رشد می‌کنند، ثابت شده است که صمغ ژلان با شفافیت با اسیل پایین، عامل ژلینگ ترجیحی در مقایسه با آگار برای شمارش یا جداسازی یا هر دو باکتری گرمادوست ارجحیت دارد. محیط مایع را می‌توان با افزودن با حدود 5/1 درصد آگار، ژلی مانند پلی‌ساکارید استخراج شده از جلبک‌های قرمز، جامد کرد که در صورت گرم شدن مایع اما در دمای اتاق جامد است.
• محیط کشت مایع: اگرچه محیط‌های جامد سال‌ها پایه اصلی در تست‌های آزمایشگاه را تشکیل داده‌اند و هنوز هم در بسیاری از مراکز مورد استفاده قرار می‌گیرند، اما استفاده از محیط‌های مایع مزایای زیادی دارند. مثلا رشد مایکوباکتریوم در محیط مایع به طور قابل توجهی سریع‌تر از
  

  

  محیط جامد است و باعث کاهش تأخیر مرتبط با کشت مایکوباکتری می‌شود. علاوه بر این، میزان جداسازی با استفاده از محیط مایع به ویژه با سیستم‌های کشت باکتری مبتنی بر مایع در دسترس تجاریبه طور کلی بالاتر از محیط جامد است.

• محیط کشت نیمه جامد: محیط نیمه جامد با غلظت 0/5درصد یا کمتر با آگار تهیه می‌شود. محیط نیمه جامد دارای یک قوام نرم مانند کاستارد است و برای پرورش باکتری‌های میکروآیروفیل یا برای تعیین تحرک باکتری‌ها مفید است.

همچنین انواع مختلفی از روش‌های کشت باکتریایی وجود دارد که براساس نوع باکتری مورد نظر یا نیاز به افتراق گونه‌های مختلف استفاده می‌شوند. به طور کلی محیط کشت باکتری به چهار دسته تقسیم می‌شود:

• محیط غیر انتخابی غنی شده: برای کشت باکتری‌هایی که در شرایط سخت زندگی می‌کنند. انواع محیط غیر انتخابی غنی شده عبارتند از:
  • بلاد آگار
  • شکلات آگار
  • مولر هینتون آگار
  • تیوگلیکونات براث
• محیط‌های انتخابی: برای کشت نمونه‌هایی همچون مدفوع، که مخلوطی از  انواع میکروب‌ها در آن‌ها وجود دارند. با افزودن مواد خاصی به محیط کشت می‌توان از رشد سایر باکتری‌ها غیر از باکتری مورد نظر جلوگیری کرد. به عنوان مثال، اگر یک میکروارگانیسم نسبت به آنتی‌بیوتیک خاصی مانند آمپی‌سیلین یا تتراسایکلین مقاوم باشد، می‌توان آن آنتی‌بیوتیک را به محیط اضافه کرد تا از رشد سلول‌های دیگر که مقاومت ندارند، جلوگیری کند. محیط‌های فاقد یک اسید آمینه مانند پرولین در ترکیب با E. coli که قادر به سنتز آن نیست، معمولاً توسط متخصصان ژنتیک قبل از ظهور ژنومیک برای نقشه برداری از کروموزوم‌های باکتریایی استفاده می‌شد.
  از محیط رشد انتخابی همچنین در کشت سلولی برای اطمینان از بقا یا تکثیر سلول‌هایی با خواص ویژه مانند مقاومت به آنتی‌بیوتیک یا توانایی سنتز یک متابولیت خاص استفاده می‌شود. به طور معمول، وجود یک ژن خاص یا آلل یک ژن، توانایی رشد در محیط انتخابی را به سلول می‌دهد. در چنین مواردی، ژن به عنوان مارکر نامیده می‌شود. محیط رشد انتخابی برای سلول‌های یوکاریوتی معمولاً شامل نئومایسین برای انتخاب سلول‌هایی است که با یک پلاسمید حامل ژن مقاومت به نئومایسین به عنوان نشانگر با موفقیت ترانسفکت شده‌اند.
  گانسیکلوویر از این قاعده مستثنی است، زیرا از آن برای از بین بردن سلول‌هایی استفاده می‌شود که نشانگر مربوط به آن، ویروس هرپس سیمپلکس، تیمیدین کیناز را دارند. چهار نوع صفحه آگار بسته به متابولیسم باکتری، رشد افتراقی را نشان می‌دهند. نمونه‌هایی از محیط کشت انتخابی:
  • ائوزین متیلن بلو: حاوی رنگ‌هایی است که برای باکتری‌های گرم مثبت سمی است. این ماده انتخابی و افتراقی برای کلی فرم است.
  • YM (عصاره مخمر، آگار عصاره مالت): دارای PH کم است و از رشد باکتری جلوگیری می‌کند.
  • آگار روده‌ای Hektoen: یک محیط انتخابی و افتراقی برای باکتری‌های گرم منفی روده ای است.
  • محیط انتخابی HIS: نوعی محیط کشت سلولی که فاقد اسید آمینه هیستیدین است.
  • آگار عصاره مخمر ذغال: بافر برای برخی از باکتری‌های گرم منفی به ویژه Legionella pneumophila
  • آگار بیرد – پارکر: برای استافیلوکوک‌های گرم مثبت
  • سابورو دکستروز آگار: به دلیل PH کم (5/6) و غلظت بالای گلوکز (3 تا 4٪) برای برخی قارچ‌ها انتخاب می‌شود.
  • مک‌کانکی آگار: مخصوص باکتری‌های گرم منفی
  • مانیتول سالت آگار: برای باکتری‌های گرم مثبت
  • زایلور لیزین داکسی کلات آگار: برای باکتری‌های گرم منفی
  • ﻟﻮﻧﺸﺘﺎﯾﻦ ﺟﺎﻧﺴﻮن آﮔﺎر: خصوصا برای تشخیص مایکوباکتریوم‌ها استفاده می‌شود.
  • میدل بروک آگار: محیط کشت جامد و مبتنی بر تخم مرغ برای کشت مایکوباکتریوم است.
• محیط‌های افتراقی: همانند محیط کشت انتخابی برای تشخیص وجود یک باکتری خاص در نمونه کاربرد دارد.
• محیط‌های اختصاصی: برای تشخیص اختصاصی باکتری‌هایی که در شرایط غیر معمول زندگی می‌کنند یا افتراق آن‌ها از سایر میکروب‌های موجود در نمونه استفاده می‌شود.

 

• صفحات آگار چه هستند؟

  کشت‌های میکروبیولوژیکی را می توان در ظروف پتری با اندازه‌های مختلف که دارای لایه نازکی از محیط رشد پایه آگار است، پرورش داد. هنگامی که محیط رشد در ظرف پتری با باکتری‌های مورد نظر تلقیح شد، صفحات در دمای مطلوب برای رشد باکتری‌های انتخاب شده انکوبه می‌شوند (به عنوان مثال معمولاً در 37 درجه سانتیگراد یا دمای بدن انسان، برای کشت از انسان یا حیوانات یا پایین تر برای کشت‌های محیطی). پس از دستیابی به سطح مطلوب رشد، می‌توان صفحات آگار را برای مدت طولانی به صورت وارونه در یخچال نگهداری کرد تا باکتری‌ها را برای آزمایش‌های بعدی نگه دارد.

  مواد افزودنی متنوعی وجود دارد که می‌توان قبل از ریختن آگار در بشقاب و اجازه سفت شدن، به آن افزود. برخی از انواع باکتری‌ها فقط در صورت افزودنی‌های خاص می‌توانند رشد کنند. این مورد همچنین می‌تواند در هنگام ایجاد سویه‌های مهندسی شده باکتری‌ها حاوی ژن مقاوم در برابر آنتی‌بیوتیک مورد استفاده قرار گیرد. وقتی آنتی‌بیوتیک انتخاب شده به آگار اضافه شود، فقط سلول‌های باکتریایی حاوی مقاومت ژنتیکی درج ژن قادر به رشد هستند. این اجازه می‌دهد تا محقق فقط کلونی‌هایی را که با موفقیت تغییر شکل داده‌اند انتخاب کند.

  قطب‌های پایه آگار نسخه کوچک شده صفحات آگار که در قالب‌های Dipstick اعمال می‌شوند. به عنوان مثال Dip Slide ،Digital Dipstick  پتانسیل استفاده در محل مراقبت را برای اهداف تشخیص نشان می‌دهند. آن‌ها مزایایی نسبت به صفحات آگار دارند مثلا مقرون به صرفه هستند و عملکرد آن‌ها به تخصص یا محیط آزمایشگاهی احتیاج ندارد و امکان استفاده در محل مراقبت را فراهم می‌کند.

 

محیط کشت بلاد آگار

دو جزء اساسی این نوع محیط کشت عبارتند از:

• محیط پایه
• خون از حیواناتی همچون گوسفند، اسب یا خرگوش
• پپتون
• عصاره گوشت گاو
• عصاره مخمر
• آگار
• NaCl
• آب مقطر

برای تکثیر کلونی‌های وسیع‌تری از میکروارگانیسم‌ها می‌توان ترکیبات مکمل دیگری نیز به این محیط افزود. Blood Agar (BA) ماده غنی شده ای است که برای کشت آن دسته از باکتری‌ها یا میکروب‌ها استفاده می‌شود که به راحتی رشد نمی‌کنند. این باکتری‌ها در مقایسه با باکتری‌های معمول نیاز به یک محیط غذایی خاص و غنی شده دارند. Blood Agar برای رشد طیف وسیعی از عوامل بیماری‌زا بخصوص مواردی که رشد آن‌ها دشوارتر است مانند Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae و گونه‌های Neisseria استفاده می‌شود. همچنین برای تشخیص و افتراق باکتری‌های همولیتیک، به ویژه گونه‌های استرپتوکوک مورد نیاز است.

این همچنین یک رسانه افتراقی است که اجازه می‌دهد همولیز (از بین بردن گلبول قرمز) توسط سموم سیتولیتیک ترشح شده توسط برخی از باکتری‌ها مانند سویه‌های خاص باسیلوس، استرپتوکوک، انتروکوک، استافیلوکوک و آئروکوک، ترشح شود. با افزودن آنتی‌بیوتیک، مواد شیمیایی یا رنگ، می‌توان آگار خون را برای برخی عوامل بیماری‌زا انتخابی کرد. به عنوان مثال می‌توان به آگار خون کریستال بنفش برای انتخاب استرپتوکوک پیوژن از سواب گلو و کانامایسین یا آگار خون نئومایسین برای انتخاب بی‌هوازی از چرک اشاره کرد.

موارد استفاده از آگار خونی یک محیط غنی شده با هدف کلی است که اغلب برای رشد ارگانیسم‌های سریع و برای تمایز باکتری‌ها بر اساس خصوصیات همولیتیک آن‌ها (β-همولیز، α-همولیز و γ-همولیز (یا غیر همولیتیک) استفاده می‌شود. درباره همولیز و انواع آن بیشتر بخوانید.

 

• محیط کشت شکلات آگار

  در واقع نوع تغییر یافته محیط بلاد آگار است که خون یا هموگلوبین به محیط پایه آن اضافه شده است. برخی از گونه‌هایی که روی بلاد آگار رشد نمی‌کنند مانند هموفیلوس را می‌توان در این محیط کشت داد. شکلات آگار (CHOC) یا شکلات آگار خون (CBA)، یک محیط رشد غیر انتخابی و غنی شده است که برای جداسازی باکتری‌های بیماری‌زا استفاده می‌شود. این یک نوع صفحه آگار خون است، حاوی گلبول‌های قرمز خون است که با گرم شدن آرام تا 80 درجه سانتی‌گراد لیز شده است. از شکلات آگار برای رشد باکتری‌های تنفسی سریع استفاده می‌شود مانند Haemophilus influenzae و Neisseria meningitidis.

  علاوه بر این، برخی از این باکتری‌ها، به ویژه H-آنفلوانزا، به فاکتورهای رشد مانند نیکوتین آمید آدنین دینوکلئوتید (فاکتور V یا NAD) و همین (فاکتور X) که در داخل گلبول‌های قرمز خون هستند، نیاز دارند. بنابراین، پیش نیاز رشد این باکتری‌ها وجود محلول‌های گلبول قرمز است. گرما همچنین آنزیم‌هایی را غیرفعال می‌کند که در غیر این صورت می‌توانند NAD را تخریب کنند. نام این آگار به دلیل رنگ آن است و حاوی هیچ محصول شکلاتی نیست. آگار شکلاتی با افزودن باسیتراسین برای جنس Haemophilus انتخابی می شود. نوع دیگر آگار شکلاتی به نام آگار Thayer-Martin شامل مجموعه ای از آنتی‌بیوتیک‌ها است که برای گونه‌های Neisseria انتخاب می شود.

 

محیط کشت مولر هنتون آگار

برای تست حساسیت باکتریایی استفاده می‌شود و شامل ترکیباتی از قبیل موارد زیر است:

• بیف
• عصاره کازئین
• نمک‌ها
• کاتیون‌های دوظرفیتی
• نشاسته محلول

• محیط کشت تیوگلیکولات براث

  محیط کشت تایوگلایکولیت (Thioglycollate Broth) برای جداسازی برخی از گونه‌های هوازی و بی‌هوازی استفاده می‌شود و انواع مختلفی از آن

  • کازئین تجزیه شده
  • گلوکز
  • عصاره مخمر
  • سیستئین
  • تیوگلیکولات سدیم

  اگر هدف کشت و جداسازی باکتری بی‌هوازی باشد، افزودن همین و ویتامین K کمک کننده هستند.

•  وجود دارند اما به طور عمده حاوی ترکیبات زیر هستند:

 

محیط کشت مک کانکی آگار

مک‌کانکی آگار (MacConkey Agar) یک محیط کشت انتخابی و افتراقی برای باکتری‌ها است. این ماده برای جداسازی باسیل‌های گرم منفی (که به طور معمول در روده یافت می‌شود) و تفکیک آن‌ها بر اساس تخمیر لاکتوز طراحی شده است. تخمیر کننده‌های لاکتوز روی آگار مک کانکی قرمز یا

صورتی می‌شوند و مواد تخمیر کننده تغییر رنگ نمی‌دهند.

این محیط از رشد موجودات گرم مثبت با نمک‌های بنفش و صفرا جلوگیری و امکان انتخاب و جداسازی باکتری‌های گرم منفی را فراهم می‌کند. این محیط با نشانگر pH قرمز خنثی تخمیر لاکتوز را توسط باکتری‌های روده‌ای مشخص خواهد کرد. محیط کشت مک‌کانکی آگار حاوی نمک‌های صفراوی (برای جلوگیری از رشد باکتری‌های گرم مثبت)، رنگ بنفش کریستالی (که برخی از باکتری‌های گرم مثبت را نیز مهار می‌کند) و رنگ قرمز خنثی (که اگر میکروب‌ها لاکتوز را تخمیر کنند صورتی می‌شود) است. ترکیبات آن به طور دقیق‌تر عبارتند از:

• پپتون
• پروتئین پپتون
• لاکتوز
• نمک‌های صفراوی
• سدیم کلراید
• قرمز خنثی
• بنفش کریستالی
• آگار
• آب

و اسیدیته آن حدود ۷/۱ باشد. بسته به نیاز انواع مختلفی از مک‌کانکی آگار وجود دارد. در صورت عدم نیاز به گسترش گونه‌های پروتئوس، کلرید سدیم حذف می‌شود. بنفش کریستالی در غلظت 0001/0 درصد (001/0 گرم در لیتر) در صورت نیاز به بررسی مهار باکتری‌های گرم مثبت در آن گنجانده شده است. مک‌کانکی آگار با سوربیتول برای جداسازی E. coli O157، یکی از پاتوژن‌های روده استفاده می‌شود.

با استفاده از نشانگر pH خنثی قرمز، آگار آن دسته از باکتری‌های گرم منفی را که می‌توانند لاکتوز قند (Lac +) را تخمیر کنند از آن‌هایی که نمی‌توانند تخمیر انجام دهند (Lac -)، متمایز می‌کند. این محیط به عنوان محیط شاخص و محیط کشتی با قدرت انتخاب کم نیز شناخته می‌شود. وجود نمک‌های صفراوی ازدحام گونه‌های پروتئوس را مهار می‌کند.

 

محیط کشت مانیتول سالت آگار

مانیتول نمک آگار یا MSA یک محیط رشد انتخابی و افتراقی است که معمولاً در میکروب‌شناسی مورد استفاده قرار می‌گیرد و رشد گروهی از باکتری‌های خاص را تقویت می‌کند در حالی که جلوی رشد سایر آن‌ها را می‌گیرد. این محیط به عنوان یکی از روش‌های تشخیص میکروب‌های بیماری‌زا در مدت زمان کوتاه در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی اهمیت دارد. محیط کشت مانیتول سالت آگار حاوی غلظت زیاد (حدود 7/5–10٪) نمک (NaCl) است که برای اکثر باکتری‌ها مهار کننده است.

وجود این غلظت از نمک باعث می‌شود MSA در برابر بیشتر باکتری‌های گرم منفی انتخابی و برای برخی از باکتری‌های گرم مثبت (استافیلوکوک، انتروکوک و میکروکوکاسه) قابل تحمل باشد. همچنین یک واسطه افتراقی برای استافیلوکوک‌های تخمیر کننده، مانیتول است، مانیتول کربوهیدرات و اندیکاتور قرمز، یک شاخص pH برای تشخیص اسید تولید شده توسط استافیلوکوک‌های تخمیر کننده مانیتول هستند.

استافیلوکوکوس اورئوس کلونی‌های زرد با مناطق زرد تولید می‌کند، در حالی که سایر استافیلوکوک‌های منفی کوآگولاز کلنی های کوچک صورتی یا قرمز تولید می‌کنند و هیچ تغییری در رنگ محیط ایجاد نمی‌کنند. اگر ارگانیسم بتواند مانیتول را تخمیر کند، یک محصول جانبی اسیدی ایجاد می‌شود که باعث زرد شدن فنل قرمز موجود در آگار می‌شود. این محیط برای جداسازی انتخابی گونه‌های استافیلوکوک در بیماری احتمالی (pp) کاربرد دارد.

ترکیبات سازنده این محیط به طور کلی عبارتند از:

• آنزیم کازئین
• آنزیمی هضم کننده بافت حیوانی
• عصاره گوشت گاو
• D- مانیتول
• کلرید سدیم
• قرمز فنول
• آگار

در اسیدیته حدود ۷/۴ و دمای 25 درجه سانتی‌گراد

 

محیط کشت XLD آگار

آگار دی اکسی کولات (XLD agar) یک محیط رشد انتخابی است که در جداسازی گونه‌های سالمونلا و شیگلا از نمونه‌های بالینی و مواد غذایی مورد استفاده قرار می‌گیرد. PH آن تقریباً 7/4 است و به دلیل شاخص قرمز، صورتی یا قرمز روشن دارد. تخمیر شکر pH را کاهش می‌دهد و نشانگر قرمز فنول با تغییر به زرد این را ثبت می‌کند. بیشتر باکتری‌های روده  از جمله سالمونلا، می‌توانند قند زایلوز را تخمیر کرده و اسید تولید کنند. مستعمرات شیگلا نمی‌توانند این کار را انجام دهند و بنابراین قرمز باقی می‌مانند.

کلونی‌های سالمونلا پس از خسته شدن منبع گزیلوز، لیزین را دکربوکسیل می‌کنند، pH را یک بار دیگر به قلیایی افزایش می‌دهند و از کلنی‌های قرمز شیگلا تقلید می‌کنند. سالمونلا تیوسولفات را متابولیزه کرده و سولفید هیدروژن تولید می‌کند که منجر به تشکیل کلونی‌هایی با مراکز سیاه می‌شود و به آن‌ها اجازه می‌دهد از کلونی‌های شیگلا با رنگ مشابه متفاوت شوند.

انتروباکتری‌های دیگر مانند E. coli لاکتوز موجود در محیط را تا حدی تخمیر می‌کنند که با برگشت کربوکسیلاسیون از برگشت pH جلوگیری کرده و محیط را به زردی اسیدی کند. تغییرات این محیط کشت در صورت وجود گونه‌های ختلف به ترتیب زیر است:

• گونه‌های سالمونلا: کلونی های قرمز، بعضی از آن‌ها دارای مراکز سیاه هستند. آگار به دلیل وجود کلونی‌های نوع سالمونلا قرمز خواهد شد.
• گونه های شیگلا: کلونی‌های قرمز
• کلی‌فرم: کلونی‌های زرد تا نارنجی
• سودوموناس آئروژینوزا: کلونی‌های صورتی و سختی ایجاد می‌کند. این نوع کلونی به دلیل شباهت‌های رنگی به راحتی می‌تواند با سالمونلا اشتباه گرفته شود.